侧向流层析、乳胶凝集、流式芯片测试和浊度测定

聚合物微球可用于侧向流层析、乳胶凝集、流式芯片测试和浊度测定等多种诊断领域的检测。微球的性能受到多种参数的影响，例如表面属性、粒径、单分散性，这些参数最终都能够影响诊断试剂的性能。因此，了解如何选择微球非常重要。

蛋白与微球的结合，很大程度上取决于微球的表面官能团及其浓度。微球的大小，则与检测灵敏度、线性密切相关。一般而言，粒径越小，对线性范围越有利；而粒径越大，则对灵敏度越有帮助。而微球的单分散性，则与批间差有关联。

因此，选择合适的微球，对开发稳定、可重复的优质诊断试剂至关重要。

表面属性对疏水吸附的影响

     微球表面，即使带有磺酸基和羧基等亲水基团的微球表面，均可与生物分子，包括蛋白、短肽、和其它小分子，发生疏水（被动）吸附。

    

     上述的物理吸附随着蛋白分子量的增大而升高。聚苯乙烯微球表面大多数是C—C键、C—H键等疏水分子链形成的区域构成的。这些区域可与生物分子的疏水区域形成物理吸附作用。蛋白与微球通过多点吸附的方式与这些区域相互作用，在混合蛋白溶液中，大分子蛋白会优先吸附到微球表面。

     因此，在蛋白质混合液的包被中，分子量大的蛋白，会优先被吸附到微球表面。在最佳的pH下，将微球和蛋白混合在一起，微球很容易对类似于抗体这类物质的进行特异性吸附，然后通过离心等方法，可将未交联的蛋白除去。

表面功能化的微球可以和蛋白质（或其它生物分子）发生共价偶联，从而实现微球与蛋白质（或其它生物分子）的共价结合。

羧基修饰微球经过EDC/NHS活化之后，很容易与蛋白质发生反应。值得注意的是，这些微球在高浓度的电解质（高达1 M的一价盐）中更加的稳定。

醛基修饰微球是将醛基修饰到微球表面。醛基可以和蛋白质的氨基通过形成希夫碱而发生反应。醛基修饰微球不需要活化，仅需一步，就能实现和蛋白质的共价偶联。

氨基修饰微球则是由羧基微球通过将羧基转变成氨基而制备得到。这类微球在某些情况下，更容易与抗体的羧基发生共价偶联。

如何计算单个官能团平均占位面计（Parking Area ,PA）

微球的单个官能团平均占位面计（Parking Area, PA）是指每个官能基团，例如羧基，在微球表面的平均占位面计。一般用Å2表示，是一项衡量基团在微球表面密度的指标，计算公式为：

其中：P为官能团平均占位面积（Parking Area，PA），单位：Å2；Dc为表面官能团密度，一般由滴定获得，单位：μeq/g微球；ρs为微球密度，单位：g/cm3；d为平均直径，单位：μm。

上述公式显示，PA值越小，则官能团平均占位面积越小，表明官能团密度密度越高。此指标考虑了粒径与官能团密度的相互关系，能跟准确地反映官能团密度，比单纯的官能团密度更真实地反映官能团的状况。

蛋白的包被

微球表面包被蛋白质有两种结合方式：被动吸附和共价交联。

（I）被动吸附

被动吸附的方式非常迅速，在微球表面增加蛋白质的量，能在短时间内形成蛋白包被层，使微球表面的蛋白达到饱和状态。我们可以根据以下经验公式，大致计算微球粒径与最大蛋白包被量之间的关系。其关系如下：

S=5.71/D

其中S为1g微球的表面积，单位：m2；D为微球直径，单位：μm。

由此可见，一定量的微球，粒径越小，则面积越大，理论上所能包被的蛋白数量也就越高。

值得注意的是，被动吸附虽然作用力很强，但并不是永久性的。很多试剂都能使微球表面的蛋白质解吸附。

（II）共价偶联

蛋白质可通过多种方式共价交联到微球表面。微球表面含有环氧基、氯甲基、醛基、羧基等基团，都可以和抗体的Fc端的氨基反应，形成共价键。当选择共价交联方式的时候，往往需要考虑交联的效期、工艺复杂程度和最后的带电状况。

前三种基团可以直接与蛋白的氨基反应，形成共价键，使用起来较方便，但储存稳定性较之羧基微球稍差。而羧基微球则需经过EDC/NHS活化之后，才与蛋白的氨基反应，形成共价键。由于羧基微球本身不具有直接和蛋白质反应的性能，因此具有较强的化学稳定性。两种方法各有优缺，在选择的时候，需根据本身的情况进行选择。

羧基微球是目前使用较多的微球，目前流行的工艺是使用EDC（+NHS）活微球的羧基，然后和抗体的氨基交联。交联后的带电状况也是很重要的问题，它直接影响到实际的稳定性。在共价交联中，羧基（或氨基），不仅仅是提供共价交联的基团而已，它们对交联之后形成的复合物的带电状况、整个体系能否维持稳定的溶胶状态，具有十分重要的作用。微球的稳定性取决于表面携带的电荷、包被蛋白的种类、数量、及缓冲液等因素。一旦处理不当，很容易引起团聚及非特异性吸附。尤其要注意的是IgG具有较低的电荷密度和较高的疏水性，交联到微球上之后，较容易破坏稳定性。