荧光显微镜附件和参考标准

为了从荧光成像应用中获得准确且可重复的结果，必须最大化实验样品中荧光信号的强度和稳定性。我们已经开发了几种有效的抗褪色试剂，可最大程度地减少荧光标记标本的光漂白。Image-iT FX信号增强器（I36933）阻止染料标记抗体的非特异性结合，从而在免疫标记细胞和组织的图像中改善信号：背景特征。我们的FluoCells显微镜载玻片可为教育和商业荧光显微镜演示提供即用型，多色标记的细胞或组织制剂。与Grace Bio-Labs合作，我们还提供多种显微镜配件，包括样品室，载玻片和盖玻片。

同样，准确和可重复的结果取决于光学系统的最佳性能。必须仔细评估染料和探针与激发光源（荧光激发源-表23.2）和发射波长滤光片的光谱兼容性（分子探针染料的光谱特性-表23.1）。可通过我们的在线Fluorescence SpectraViewer工具（www.invitrogen.com/handbook/spectraviewer，使用Fluorum SpectraViewer-注23.1）获得可下载的参考光谱，有关选择滤光片的指南，请参见为荧光显微镜选择滤光片-注23.2。。高精度荧光探针成像还需要仔细的校准和仪器调整，特别是在涉及多次曝光，重复扫描或三维切片的多色应用中。我们提供各种微球参考标准品，旨在促进常规荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜的调整和校准。此外，参考染料采样器套件（R14782）提供了现成的储备溶液，该储备溶液具有五种广泛表征的荧光标准品，可用于分光荧光计和荧光酶标仪。我们也是NIST可追踪的荧光素标准品（F36915），可直接追溯到美国国家标准技术研究所采用和维护的荧光素标准。

防褪色试剂和固定介质

由于不可逆的光漂白过程造成的荧光损失会导致灵敏度显着降低，特别是当目标分子的丰度低或激发光的强度高或持续时间长时。为了最大程度地减少实验样品的光漂白，我们开发了ProLong，ProLong Gold，SlowFade和SlowFade已显示出Gold Antifade试剂盒和试剂可增加固定细胞，固定组织和无细胞制剂中许多荧光团的光稳定性。任何抗褪色剂的主要功能是维持染料荧光，通常是通过抑制活性氧的产生和扩散来实现的。避免光漂白的其他策略包括通过使用高数值孔径物镜和低倍率来降低激发光强度，以及对激发光的空间和时间分布进行硬件控制。通过使用高质量的滤光片和高效的光电探测器，可以在一定程度上补偿由于衰减激发而导致的荧光信号损失。

ProLong金抗褪色试剂

ProLong Gold防褪色试剂是ProLong防褪色试剂的改进版，ProLong防褪色试剂盒是以下所述的组件。的延长Gold抗淬灭试剂导致荧光信号的很少或没有淬火，同时保护样品从光漂白（图23.1.1，）。此外，与ProLong防褪色试剂盒中的试剂不同，ProLong黄金防褪色试剂已预先混合并可以使用，只需在制备和安装过程中滴一滴即可。与我们的原始ProLong防褪色试剂一样，ProLong Gold试剂可在24小时内固化，并且样品在安装后可以保存几个月。ProLong Gold试剂与多种染料和染料配合物具有出色的相容性，使其成为用于多色应用的特别有价值的工具（）。ProLong Gold防褪色试剂有一个10 mL瓶（P36930）和一个2 mL瓶（P10144），以及五个5 mL 2 mL瓶（P36934）。

为了增加便利，我们还提供了ProLong Gold防褪色试剂，其中含有DAPI，这是一种流行的核和染色体染色剂，与DNA结合后会发出蓝色荧光。在安装介质中添加DAPI无需再进行单独的复染步骤。带有DAPI的ProLong Gold防褪色试剂可在单个10 mL瓶（P36931）和单个2 mL瓶（P36941）中以及一组五个2 mL瓶（P36935）中获得。

图23.1.1 ProLong Gold和SlowFade Gold抗褪色剂可增强抗光漂白性。荧光素标记的微球安装在A）装有ProLong Gold防褪色试剂（P36930，P36934）或ProLong防褪色试剂盒（P7481）或B）与SlowFade防褪色试剂（S36936，S36937）或SlowFade防褪色试剂盒（S2828）），并使用100瓦汞弧灯照明30秒。使用40×/ 1.3 NA油浸镜头对Sampels进行成像，并使用12位单色CCD相机进行采集。所有图像均使用相同的曝光设置。绘制的数据是20个微球的平均荧光强度。

ProLong防褪色套件

ProLong防褪色试剂盒（P7481，）包含我们原始的ProLong防褪色试剂，该试剂已被证明可有效增强许多不同的荧光团对光漂白的抵抗力。此外，使用ProLong Antifade Kit安装的标本对大多数染料的荧光信号几乎没有或没有猝灭。

每个ProLong防褪色套件均包含：

• ProLong防褪色试剂粉
• ProLong安装介质
• 安装样品的详细协议（ProLong Antifade Kit） 

牛肺动脉上皮用荧光素标记鬼笔环肽（细胞（BPAEC）F432光漂白，以在PBS中30秒初始值的约12％），在初始值相同的照明条件下停留使用的ProLong抗荧光淬灭试剂盒在安装时同时（） 。如图23.1.2所示，当用于安装荧光素染色的HEp-2细胞时，ProLong防褪色试剂盒提供的荧光输出比流行的含对苯二胺的防褪色试剂提供更多。ProLong防褪色剂还抑制四甲基罗丹明的褪色，以及与DNA结合的核酸染料（如DAPI，碘化丙啶和YOYO-1）的褪色（核酸污渍，第8.1节）），而又不会显着淬灭这些染料的荧光。ProLong防褪色剂与多种染料和染料配合物的相容性使其成为进行多色分析程序（例如多重荧光原位杂交（FISH））的特别有价值的工具。

˚F igure 23.1.2 A的漂白概况）荧光素和B）的细胞样品在德克萨斯红染料缀合物。在这些光漂白实验中，用人抗核抗体探测人上皮（HEp-2）细胞，然后用荧光团标记的第二试剂显影。将相同的样品安装在ProLong防褪色试剂（：P7481），产品X（+）或不含防褪色试剂的培养基（）中。尽管这些数据已标准化，但我们观察到用ProLong固定介质固定的样品几乎没有淬灭。

SlowFade防褪色套件

我们最初的SlowFade抗褪色配方（S2828）旨在将荧光素的褪色率降低至几乎为零。由于它提供的荧光素几乎恒定的发射强度，因此这种SlowFade防褪色试剂特别适用于定量测量和采用共聚焦激光扫描显微镜的应用。但是，这种原始的SlowFade配方基本上淬灭了荧光素的荧光，几乎完全淬灭了Alexa Fluor 350，Alexa Fluor 405和Cascade Blue荧光团。

每个SlowFade防褪色套件均包含：

• SlowFade抗褪色剂，含50％（v / v）甘油，可立即使用，足以进行至少200次盖玻片大小的实验
• 浓缩的SlowFade防褪色试剂溶液，用于甘油可能不兼容的那些应用
• 平衡缓冲液，可提高样品的pH值，增强SlowFade防褪色配方提供的保护
• 安装样品的详细协议（SlowFade Antifade试剂盒）

SlowFade金抗褪色试剂

为了克服原始SlowFade抗褪色剂的局限性，尤其是蓝色荧光团，我们开发了SlowFade Gold抗褪色剂。所述的SlowFade Gold抗淬灭制剂减慢荧光素的褪色约五倍而不显著减少荧光素的初始荧光强度，从而显着地增加在显微照相的信噪比率。此外，Alexa Fluor 350，Alexa Fluor 405，级联蓝，四甲基罗丹明和德克萨斯红的淬灭作用很小。实际上，SlowFade Gold抗褪色剂可将级联蓝荧光团的褪色率降低至几乎为零，而其发射强度仅降低约30％。

所述的SlowFade Gold抗淬灭试剂在单个10毫升瓶（可用S36936），并在一个单一的2毫升瓶（S36940），以及在一组五个2毫升瓶（S36937）。与ProLong Gold防褪色试剂一样，我们还提供了SlowFade Gold防褪色试剂，其中含有蓝色荧光核复染DAPI。带有DAPI的SlowFade Gold抗褪色试剂可在单个10 mL瓶（S36938）和单个2 mL瓶（S36942）中以及五个5 mL 2 mL瓶中一组（S36939）中获得。这些试剂可以同时进行核染色，并保护染色的样品免于光漂白。

与ProLong和ProLong Gold防褪色试剂不同，SlowFade和SlowFade Gold防褪色试剂不会随时间固化，因此可以立即查看样品。但是，SlowFade Gold试剂仅供短期使用（3-4周），安装的样品可能会在更长的时间内降解。当使用高倍物镜或准备样品进行存储和随后的成像时，建议用蜡或指甲油对盖玻片进行二次密封。

Qmount Qdot安装介质

Qdot纳米晶体的独特物理特性（第6.6节“ Qdot纳米晶体”）使其与ProLong Gold，SlowFade Gold和其他主要用于有机染料的固定介质不兼容。Qmount Qdot固定剂（Q10336）是一种特殊的固定剂，可以保留Qdot纳米晶体的荧光信号，而几乎不会消除信号的初始强度。该制剂可在12小时内固化，并提供在方便易用的滴管瓶中。这种封固剂与所有八种Qdot纳米晶体光谱类型（Qdot纳米晶体，第6.6节）及其共轭物以及核复染色Qnuclear深红色染料（Q10363）具有出色的兼容性。，《原子核探针》（第12.5节），使其成为用于多色Qdot纳米晶体成像应用的特别有价值的工具（图23.1.3）。不建议将Qmount Qdot安装介质与Alexa Fluor染料或荧光蛋白一起使用。

图23.1.3用Qdot纳米晶体标记并用Qmount培养基固定的人类癌细胞（HeLa）。用抗-OxPhos复合物V抑制剂蛋白IgG（A21355）检测线粒体，并用Qdot 625山羊F（ab'）2抗小鼠IgG抗体标记（A10195，红色荧光）；高尔基体用兔抗-giantin抗体检测，并用Qdot 585山羊F（ab'）2抗兔IgG抗体标记（Q11411MP，黄色荧光）；用大鼠抗微管蛋白抗体检测微管蛋白，并用DSB-X生物素山羊抗大鼠IgG抗体（D20697）和Qdot 525链霉亲和素（Q10141MP，绿色荧光）。细胞核标记有Qnuclear深红色染色剂（Q10363，紫色荧光），载玻片装有Qmount Qdot安装介质（Q10336）。