利用EarlyTox细胞活力检测试剂盒评估GM-CSF和TNFα诱导的细胞凋亡

前言：

肿瘤坏死因子(TNFα)是一个关键的细胞炎症因子，它可以通过许多细胞通路来调控各种细胞事件。此因子是在造血细胞中引起凋亡而被人们熟知的，如U937，通过激活细胞内半胱天冬酶的级联过程。另一方面，粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是 造血生长因子成员之一，可促进增殖和/或分化。然而，有报道称U937细胞会应答 GM-CSF而发生生长抑制和凋亡。因为TNFα和GM-CSF都会在U937细胞中引起 凋亡，但这两种细胞活素之间有着不同的时间进程。当两者结合起来，两种细胞活素的高度协同作用便会被观察到。

EarlyTox™细胞活力试剂盒是评价细胞生 长条件的一类试剂之一，包括细胞活性和各种凋亡事件。这些试剂设计为均相免洗实验并针对荧光微孔读板机做了优化。这里,我们使用三种不同的试剂盒, Live/Dead测定、Caspase-3/7 R110测定和Caspase-3/7 NucView 488测定来检测TNFα 和GM-CSF处理U937细胞的效果(图 1)

• EarlyTox™ Live/Dead检测试剂盒包含两种针对哺乳动物活细胞或死细胞的标记物。Calcein AM是一种广泛用于活细 胞的标记物，而溴化乙锭二聚体-III (EthD-III)通过受损的细胞膜进入死细胞与DNA结合以产生明亮的红色荧光。

• EarlyTox™ Caspase-3/7 R110检测试剂盒提供一步、均相测定，只需细胞裂解 来对凋亡过程进行终点法分析。

• EarlyTox™ Caspase-3/7 NucView 488 检测试剂盒能够通过利用NucView 488 Caspase-3底物在未受损细胞群中检测 凋亡细胞。这种试剂对细胞无毒并且可 用于凋亡的动态学研究。

在这一基于细胞的实验中，荧光信号通过 SpectraMax® i3x微孔读板机上底读孔域扫 描功能进行检测，可获得孔底12个位置的 平均信号以避免因为潜在的细胞生长不均 所造成的孔与孔之间的差异。

 

材料：

• U937细胞(ATCC Cat.# CRL-1593.2)

• 细胞因子：

• 人类TNFα (Peprotech Cat# 300-01)

• 人类GM-CSF (Peprotech Cat# 300-03)

• EarlyTox细胞活力试剂盒(Molecular Devices, LLC)：

• EarlyTox Live/Dead检测试剂盒(Cat.# R8340)

• EarlyTox Caspase-3/7 R110检测试剂盒(Cat.# R8346)

• EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488检测试剂盒(Cat.# R8348)

• PBS•96-孔，平底，底透，黑色TC-处理的微孔板(Corning cat. #3904)

• SpectraMax i3x多功能微孔读板机和 SpectraMax® MiniMax 300成像细胞计数仪

方法：

细胞培养和处理

U937细胞培养在RPMI1640培养基中，添加10%FBS和青霉素/链霉素。

实验当天，细胞以100,000细胞/80 µL/孔接种。每孔加入20 µL的5X浓度细胞因子，其终浓度为1X且体积为100 µL。在37C、5%CO2下孵育处理24或48小时

细胞活力和凋亡测定

处理之后，准备好的试剂按照以下描述添 加于每孔中。

活/死测定：2X的calcein AM/EthD-III 工作液由calcein AM和EthD-III储存液加入到PBS中配成浓度6 µM制成。100 µL的2X工作液添加于每个检测孔中，终体积为 200 µL且每种染料的终浓度为3 µM。孔板 在室温下孵育1小时,避光。使用如表1中的设置在SpectraMax i3x读板机上检测荧光。

Caspase-3/7 R110测定:底物测定缓冲液 由酶底物(AC-DEVD)2-R110 (2 mM)加入细胞裂解/测定缓冲液中并以50 µL对1 mL的 比例混合而成。100 µL底物测定缓冲液加 入到每个孔中，形成每孔终体积为200 µL 和终浓度为50 µM体系。样品接下来在室温下避光孵育1小时。使用表1中的设置在 SpectraMax i3x读板机上检测荧光。

Caspase-3/7 NucView 488测定：10µM2X的NucView 488底物工作液混合于PBS中。100µL底物工作液加入含有100 µL细 胞和培养基的孔中形成终浓度为5µM。细 胞在室温下避光孵育1小时。使用 SpectraMax MiniMax细胞计数仪在 541nm绿色荧光通道下进行图像采集，或者在SpectraMax i3x读板机上检测。请见 表1读板机设置。

结果

结果显示U937细胞在用TNFα处理时会以剂量和时间依赖的方式经历凋亡过程。 GM-CSF对U937细胞处理达48小时却无任 何效果。然而，可以观察到当细胞与TNFα和GM-CSF混合物一起孵育时会出现明显的协同作用.曾经报道过单独的GM-CSF 相对于TNFα需要更长时间(72小时后)才能 通过caspase 3类通路诱导U937细胞的凋亡，而这两种细胞因子的协同作用却可以 在24小时后观察到。在我们的研究中，这一协同性直到48小时后才变得明显。请见图2-5。

总结

通过使用三种不同试剂来检测细胞凋亡的不同数据，我们阐明了即混即读式的实验模板可简化悬浮细胞的测定过程。 SpectraMax i3x读板机的孔域扫描功能降低了孔与孔之间的差异，校正了整孔细胞生长和分布不均一的问题。细胞活力检测 试剂家族提供给研究者们多种多样的检测 凋亡和/或细胞死亡等细胞事件的有力工具.